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銀屑病患者腸道菌群多樣性分析:單中心前瞻性研究_區進行

  • 小白兔

  • 2019-07-09 16:07:14

銀屑病是一種難治性、易復發的炎症性面板病,其病因及發病機制尚不完全明確,可能與遺傳、免疫、感染等因素有關[1]。近年研究發現,腸道菌群失調與銀屑病發病相關[2],但尚不清楚銀屑病患者腸道菌群結構與功能的具體改變。

本研究基於新一代測序技術,對細菌16S rDNA高變區進行測序,分析銀屑病患者腸道菌群的結構變化和多樣性資訊,為銀屑病的病因研究及治療方法提供參考。

1.1 樣本篩選及分組

前瞻性收集並分析2017年5月至2018年6月期間,在中國醫學科學院面板病研究所住院治療的銀屑病患者(銀屑病組)的臨床資料及糞便標本,同時按照年齡及性別匹配的原則, 選取同期在本院體檢的健康人(健康組)作為對照。

銀屑病患者納入標準:

(1)經2名或2名以上主治或以上職稱的醫師診斷為銀屑病;

(2)江蘇省南京市及周邊縣市常住居民,近1年無外地久居經歷。

排除標準:

(1)合併消化道出血、糖尿病、高血壓等其他系統性疾病;

(2)1個月內有痔瘡發作、腹瀉等影響糞便形態及主要成分者;

(3)採集標本前1個月內服用過抗菌藥物、類固醇藥物、中草藥製劑及其他可能影響消化道菌群製劑;

(4)採集標本前1周內服用過酸奶、米酒及微生物製劑;

(5)產褥期、哺乳期及妊娠者。

健康對照者納入標準為南京市及周邊縣市健康常住居民,近1年無外地久居經歷;排除標準同銀屑病患者。

本研究獲得中國醫學科學院面板病研究所倫理委員會批准 [倫理審批專案號(2017)臨審第(022)號],所有受試物件均瞭解並理解實驗細節,自願簽署知情同意書。

1.2 標本採集

取無菌袋採集受試者的新鮮糞便,立即放入冰盒後轉移入實驗室,取樣2 h內分裝2 g糞便樣本入1.5 ml無菌離心管,置入-80 ℃冰箱凍存。

1.3 DNA提取及PCR擴增

嚴格按照TIANGEN糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328,天根生化科技有限公司,北京)的說明進行操作,提取糞便標本DNA。DNA樣本經Qubit 2.0熒光定量(Invitrogen,美國)驗證後,選擇16S rDNA的V3~V4高變區作擴增和測序目的片段,引物序列為341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′,806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

配置PCR混合液,使用美國Biosystems試劑盒進行PCR擴增,擴增條件為:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共計25個迴圈;72 ℃延伸5 min,4 ℃儲存。PCR產物利用瓊脂糖凝膠電泳,選擇465 bp條帶,割膠並回收純化目標條帶。

1.4 16S rDNA測序

使用美國Illumina測序儀,參照儀器說明書,將擴增溶液等濃度匯入IlluminaMiSeq測序儀,採用雙端2×300策略測序,利用儀器自帶軟體,即MiSeq控制軟體(MiSeq Control Software,MCS,美國)進行影象分析和資料轉化。

1.5 資訊處理

原始Reads拼接、質控後的Tags,基於Gold資料庫使用Usearch軟體(Version 8.1.1861)Uchime法過濾嵌合體序列,獲得最終有效Tags。將有效Tags利用QIIME軟體(Version 1.9.1)的Uclust方法相似性聚類,將大於97%的相似性聚類分為一個分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU),選取每個OTU的代表序列,利用QIIME軟體(Version 1.9.1),對照Silva資料庫(Release 119)進行物種註釋和分類。

1.6 統計學處理

採用QIIME軟體(Version 1.9.1)計算α多樣性主要指數,包括觀測到的OTU數目、趙氏指數、夏農指數、辛普森指數。β多樣性分析策略基於所有樣本的加權和非加權UniFrac距離,進行PCoA聚類分析,作圖展示R(Version 3.4.1)。

採用SPSS 22.0軟體,通過Kolmogorov-Smirov檢驗變數是否服從正態分佈,正態分佈樣本分析方法為Welchs t檢驗,資料結果以均數±標準差表示,P<0.05為差異有統計學意義,GraphPad Prism 5.01作圖展示。非正態分佈樣本採用中位數(四分位間距)表示,基於R軟體(version 3.5.1)採用秩和檢驗分析得到P值,再利用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate方法修正P值,以P<0.05為差異有統計學意義。

2.1 一般臨床資料

符合入選和排除標準的11例銀屑病患者和21例健康人入選本研究。11例銀屑病患者中,男性9例,女性2例,其中尋常型銀屑病6例,泛發性膿皰型銀屑病3例,關節病型銀屑病2例,年齡(39.7±15.6)歲,體質量指數(body mass index,BMI)為 (22.47±2.81)kg/m2;健康組男性17例,女性4例,年齡(36.1±11.2)歲,BMI為(23.10±2.61) kg/m2;兩組性別構成比、年齡及BMI均無統計學差異(P均>0.05)。

2.2 資料質量控制

自測序的32份標本共獲得1 691 661條有效Tags序列,所有樣本有效Tags序列長度均值在252~422 bp之間,平均359 bp;樣品測序深度在99%~100%之間,所有樣品測序深度充分。

2.3 OTU數目

健康組OTU數目(722.95±152.81)顯著高於銀屑病組(278.18±89.75)(t=10.36,P<0.01)。

2.4 α多樣性分析

選用趙氏指數表現菌群豐富度,銀屑病組的趙氏指數(433.38±147.47比1156.08±292.50,t=9.291,P<0.01)、夏農指數(3.56±0.87比5.73±0.78,t=6.972,P<0.01)和辛普森指數(0.79±0.15比0.94±0.04,t=3.287,P<0.01)均顯著低於健康組(圖1)。

趙氏指數曲線顯示健康組末端斜率整體高於銀屑病組(圖2),夏農指數曲線顯示各樣品曲線趨於平坦(圖3),二者均可區分銀屑病組與健康組。Rank-Abundance曲線顯示銀屑病組曲線整體斜率較健康組大,曲線較窄(圖4)。

2.5 β多樣性分析

32個樣本PCoA分析(unweighted)結果顯示,銀屑病組與健康組在第一主成分(24.35%)可顯著分離(圖5)。

對樣本進行Weighted UniFrac分析,去除樣本丰度差異,顯示銀屑病組混雜在健康組樣本中無法明顯區分,且與銀屑病亞型無關(圖6)。

2.6 微生物群落組成

銀屑病組與健康組的腸道菌群存在506個OTU重合,除重疊菌群外,健康組特異性菌群OTU為3625個,銀屑病組為1316個,健康組的OTU數量顯著高於銀屑病組。

門層級,健康組可檢測到TM7(即Saccharibacteria)的相對丰度為0.000 066 9(0.000 033 4~0.000 200 5),銀屑病組僅在個別樣本中顯示有微量存在,相對丰度為0(P<0.05)。

屬層級,銀屑病組的雙歧桿菌屬[0.000 033 4 (0.000 016 7~0.000 100 3)比0.000 401 1(0.000 200 5~0.001 337 0)]、布勞特氏菌屬[0.000 467 9(0.000 183 8~0.000 434 5)比0.002 206 0(0.000 935 9~0.005 582 0)]、糞球菌屬[0.000 033 4(0~0.000 401 1)比0.000 902 5(0.000 334 2~0.005 315 0)]顯著低於健康組,健康組中的戴阿利斯特桿菌屬(小桿菌屬)[0.000 902 5(0.000 668 5~0.027 270 0)]和嗜血菌屬[0.000 534 8(0.000 133 7~0.005 482 0)]僅在銀屑病組個別樣品中微量存在,克雷伯氏桿菌在健康組和銀屑病組的個別樣品中存在,但在銀屑病組的相對丰度更低[0.000 100 3(0~0.000 267 4)比0](圖7)(P均<0.05)。

進一步分析樣本中丰度差異較大的菌種,標準正態分佈化熱圖顯示個體間物種存在差異:在綱層級,銀屑病組腸道菌群具有較高水平的梭菌綱、α變形桿菌綱、疣微菌綱、細梭菌綱、甲烷桿菌綱,且特異性高(圖8);屬水平可細化至甲烷短桿菌屬、巨球型菌屬、嗜黏蛋白阿克曼氏菌屬、細梭菌屬、嗜膽菌屬、考拉桿菌屬等(圖9)。

本文利用16S rDNA測序技術,首次對江蘇省南京市地區銀屑病患者及健康人群腸道菌群的構成及多樣性進行分析,發現銀屑病患者腸道菌群多樣性顯著低於健康人群。

銀屑病是一種伴有多基因遺傳缺陷、由多種誘發因素所致的自身免疫性疾病,感染為常見誘發因素之一。學術界很早就開始關注銀屑病與微生物之間的關係,A組β-溶血性鏈球菌的扁桃體感染與銀屑病發病密切相關[3],腸炎可使銀屑病惡化[4],提示“消化道-面板軸”的存在。2000年,Scarpa等[5]在15例無腸病症狀的銀屑病患者中發現了腸道炎症的亞臨床組織學及分子標誌物,進一步證實銀屑病的面板、關節表現與腸道病變的關聯。

腸道微生物群與人類共生,其組成隨時間推移而變化,當飲食長期改變或整體健康狀況發生變化時,微生物群也隨之發生改變[6]。本研究納入的觀察物件均為江蘇省南京市及周邊地區的常住居民,儘可能排除地域環境及飲食習慣產生的影響,並控制可導致腸道菌群差異的肥胖、疾病、藥物、飲食和其他近期事件。有研究[7]指出,不同國家人群之間糞便微生物群的系統發育組成存在顯著差異,細菌群落的系統發育組成在出生後3年內逐漸演變為成人樣構型,兒童間的人際差異顯著大於成人。本研究中兩例14歲女性銀屑病患者的糞便樣本均屬成人樣構型,與其他研究物件一致。

本研究對細菌16S rDNA基因中的V3~V4高變區進行基因擴增和測序。Silva資料庫(Release 119)對樣本的覆蓋率高達99%~100%,夏農指數曲線提示各樣品曲線趨於平坦,說明樣本量充分,測序數量合理。

銀屑病組腸道菌群的種類、夏農指數、辛普森指數顯著低於健康組,說明銀屑病患者的腸道菌群多樣性降低。趙氏指數曲線顯示健康組末端斜率整體高於銀屑病組,提示健康人群可能含有更豐富的腸道菌群新物種。夏農指數曲線、趙氏指數曲線、Rank-Abundance曲線均可明顯區分健康組和銀屑病組的樣本,其中Rank-Abundance 曲線中健康人樣本整體曲線平滑,橫座標較寬,提示健康人腸道菌群的物種相對丰度更高,分佈也更均勻。一項以美國居民為受試物件的研究[8]顯示,銀屑病患者腸道菌群相對丰度普遍降低,與本研究在黃種人糞便樣本分析中所得的結果一致。腸道菌群多樣性的降低與免疫介導的炎症相關性疾病有關,包括炎症性腸病[9]及類風溼關節炎[10]等。

在β多樣性分析中,PcoA圖顯示有24.35%的主成分差異,可完全區分兩類人群的糞便標本,但對差異率貢獻最大的前兩個差異值分別為24.35%和8.61%,比例相對較低,說明銀屑病患者和健康人腸道菌群有明顯群體差異,但差異並未集中於某一特定物種。Weighted UniFrac分析顯示, 因去除樣本丰度差異,銀屑病組樣本混雜於健康組中,提示銀屑病患者腸道菌群的進化譜系與健康人無顯著差異,且不同亞型的銀屑病患者腸道菌群進化譜系無差異。

人類腸道菌群中最主要的菌群包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門[11]。最初的細菌群體通常是兼性厭氧菌。研究人員認為,這些初始定植微生物會降低腸道中的氧氣濃度,利於擬桿菌、放線菌和厚壁菌等厭氧菌的定植和繁殖,主要菌群的相對丰度對維持腸道菌群穩態起重要作用[12];其他常見的菌群包括糞腸球菌、大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌、雙歧桿菌、金黃色葡萄球菌、乳酸桿菌等。銀屑病患者具有大多數的腸道常駐菌群,但也存在特異性菌群,特異性菌群種類佔總菌群的比例顯著少於健康組,提示銀屑病患者腸道菌群多樣性總體下降。

銀屑病患者與健康群體的腸道菌群在不同層級中均有顯著差異。在門層級,健康人中可檢測到的TM7(即Saccharibacteria),僅在銀屑病患者個別樣品中微量存在。TM7在成人腸道中的功能尚不明確,目前有研究顯示TM7的丰度及基因多樣性升高與黏膜炎症水平正相關[13-14];在屬水平,銀屑病患者的腸道定植菌群及參與短鏈脂肪酸代謝的糞球菌屬、布勞特氏菌屬、腸道共生菌雙岐桿菌屬丰度較健康人降低,在健康人中存在的條件致病菌克雷伯氏桿菌屬、嗜血菌屬、戴阿利斯特桿菌屬僅在銀屑病患者個別樣本中微量存在。物種差異分析進一步證實,銀屑病患者腸道菌群多樣性較健康人低,這種降低也許並非直接引起腸道黏膜炎症,而是通過菌群參與脂肪酸等物質代謝間接影響宿主免疫。

4大菌門中,相對丰度最不穩定的是變形菌門[15],變形菌門的丰度可因疾病狀態不同而快速改變[16],本研究個體分析亦發現,銀屑病患者具有較高水平的α變形桿菌綱;銀屑病患者在綱水平具有較高的梭菌綱、疣微菌綱、甲烷桿菌綱,屬水平可見甲烷短桿菌屬、巨球型菌屬、嗜黏蛋白阿克曼氏菌屬、細梭菌屬、嗜膽菌屬、考拉桿菌屬等。甲烷短桿菌屬可通過消耗細菌發酵的最終產物,對多糖高效消化起重要作用;嗜黏蛋白阿克曼氏菌屬可能會減少肥胖、糖尿病和炎症的發生,其增多與多發性硬化症有關[17];嗜膽菌屬在正常人糞便菌群中可見,但更多見於闌尾炎患者的腹腔膿腫中,人腸來源的該菌株可引起小鼠全身性炎症反應[18];考拉桿菌屬在人體內廣泛定植並與短鏈脂肪酸(包括醋酸酯和丙酸酯)的產生相關。

近期一項研究通過16S rRNA高通量測序及微生物資料庫比對分析,發現銀屑病和銀屑病關節炎患者的糞便樣本中腸道菌群生物多樣性明顯降低,多種消化道菌種總體減少,而銀屑病關節炎患者的菌群丰度變化更為顯著,表現為嗜黏蛋白阿克曼氏菌屬、瘤胃球菌屬和假丁酸弧菌屬減少,而銀屑病患者則表現為副桿狀菌屬、糞芽孢菌屬的相對丰度降低[8]。這一結果與本研究對嗜黏蛋白阿克曼氏菌的發現並不一致,尚需更多樣本驗證,但可推測,銀屑病患者的腸道菌群變化並非單一致病菌的增加或打破腸道微生物群落的平衡狀態,而是在相對穩態下出現與健康人腸道菌群總體上的差異。

由於銀屑病患者多有短期內抗菌藥物或其他影響消化道微生物菌群的用藥歷史,限制了臨床樣本的採集範圍,樣本量有限為本研究的一大不足,需進一步開展更大樣本、不同銀屑病亞型的臨床研究及動物實驗,進一步探索腸道菌群在銀屑病發生髮展中的作用機制。

總之,本研究通過細菌16S rDNA的擴增、測序及生物資訊學分析,探討了銀屑病疾病狀態下腸道菌群的多樣性特徵,發現銀屑病患者較健康人的腸道菌群多樣性顯著降低,為進一步探究腸道菌群與銀屑病的關係提供了理論依據。

參考文獻略

第一作者簡介:

王麗瑋

北京協和醫學院、中國醫學科學院面板病研究所博士生,導師為李岷主任醫師。從事面板病學臨床及面板病與固有免疫方向的科研工作,以第一作者發表中文核心論文6篇。

通訊作者簡介:

李岷

中國醫學科學院面板病醫院(研究所)院所長助理,主任醫師,博士生導師。

中國醫學科學院學術委員會委員,江蘇省醫學會面板性病學分會副主任委員,,中國醫療保健國際交流促進會面板科分副主委,中華醫學會面板性病學分會面板真菌學組副組長,

中國菌物學會醫學真菌專業委員會委員、中國微生物學會真菌專業委員會委員。國際面板性病學雜誌編委、中華面板科雜誌通訊編委。

已在國際及國內專業期刊發表論文100餘篇,其中SCI論文30餘篇。參編專業著作10餘部。承擔包括國家自然科學基金等多項課題。獲協和學者特聘教授等人才專案。

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